快速免疫荧光试剂盒
TSA荧光多标检测操作流程
【原理】
TSA主要原理是利用酪胺Tyramide的过氧化物酶反应(酪胺盐在HRP催化H202下形成共价键结合位点)，产生大量的酶促产物，该产物能与周围的蛋白残基(包括色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基)结合，这样在抗原-抗体结合部位就有大量的生物素沉积，与随后加入的Streptavidin—HRP/荧光基团结合，经几次这样的循环放大，可以结合大量的酶分子or荧光基团，结果使其检测信号得到几何级放大
【试剂及材料】
1、实验器材
名称
厂家
型号
脱水机
上海徕卡仪器有限公司
ASP300
包埋机
天津天利航空机电有限公司
BMJ-IB
病理切片机
上海徕卡仪器有限公司
RM2235
冻台
武汉俊杰电子有限公司
JB-L5
组织摊片机
武汉俊杰电子有限公司
JK-5
烤箱
DHG-9960A
粘附载玻片
江苏世泰实验器材有限公司
188105
盖玻片（24*32mm）
江苏世泰实验器材有限公司
10212432C
刀片
日本羽毛牌
R35
病理切片扫描仪
3DHISTECH
PANNORAMIC SCAN II
2、主要实验试剂
试剂名称
厂家
货号
无水乙醇
国药集团化学试剂有限公司
100092683
二甲苯
国药集团化学试剂有限公司
10023418
国药集团化学试剂有限公司
10019318
国药集团化学试剂有限公司
10016318
磷酸二氢钾
国药集团化学试剂有限公司
10017618
磷酸氢二钠，无水
国药集团化学试剂有限公司
2004061933
Tris-base
Sigma
648310
EDTA
Sigma
E9884
DAPI
abcam
ab104139
剥离液
Runnerbio
Bry-R001
封闭液
Runnerbio
Bey-B001
3、一抗及二抗信息
一抗试剂名称
厂家
货号
稀释比
二抗信息（试剂盒里面包含二抗及DAB显色系统）
HRP Conjugated Goat anti-Rabbit IgG UltraPolymer Antibody
华安生物
HA1119
Ready-to-use
HRP Conjugated Goat anti-Mouse IgG UltraPolymer Antibody
华安生物
HA1120
Ready-to-use
2、主要实验试剂：
TSA试剂盒
CF 488 Tyramide
runnerbio
Bry-880488
即用型
CF 594 Tyramide
runnerbio
Bry-880594
即用型
cy3 Tyramide
runnerbio
Bry-880530
即用型
AF 647 Tyramide
runnerbio
Bry-880647
即用型
CF 754 Tyramide
runnerbio
Bry-880754
即用型
480 Tyramide
runnerbio
Bry-880480
即用型
3、组织样本类型：人肿瘤，组织芯片，
样本1：
【操作流程】
1) 石蜡切片考片62℃烤片1h。
2) 切片脱蜡：组织切片置于三缸二甲苯中，每缸浸泡10分钟；
3) 水化：
a) 无水乙醇中浸泡2min；
b) 无水乙醇中浸泡2min；
c) 95%乙醇中浸泡2min；
d) 95%乙醇中浸泡2min；
e) 70%乙醇中浸泡2min；
f) 自来水水洗5分钟；
g) 蒸馏水清洗；
4) 将切片放入荧光淬灭试剂中，用光萃仪器荧光淬灭15min，(去除背景荧光和自发荧光)。
5) PBS洗涤3次，每次5min；
6) 热抗原修复（1mmol Tris-EDTA PH=9.0）：
a) 将洗涤的片子放入到塑料的架子上面，置于电高压锅中4min，室温自然冷却。
7) PBS洗涤3次，每次5min；
8) 除去PBS，每张片子加100ul的封闭液，室温孵育5min.
9) 去除血清，每张片子加入100ul的第一种一抗，室温1h
10) PBS洗涤3次，每次5min；
11) 除去PBS每张片子加入100ul标记的二抗，37℃下孵育20-30min；
12) PBS洗涤3次，每次5min；
13) 每张片子加入50ul的CF 594 Tyramide酪胺转换试剂，室温下孵育3-10min；
14) PBS洗涤3次，每次5min；
15) 重复操作步骤6-11(此时修复方法更换为剥离液，37度10min)。在第9步的时候加入更换第二中一抗100ul；
16) 每张片子加入50ul的第二种CF 488 Tyramide酪胺转换试剂，室温下孵育3-10min；
17) PBS洗涤3次，每次5min；
备注：重复操作6-11步，在第9步更换一抗，第11添加对应的hrp标记的二抗，第13步用酪胺转换试剂进行标记。直到做完需要标记的一抗。
18) 除去PBS每张片子加入100ul的防荧光淬灭封片剂（含DAPI），Digital Slide Scanners 机器扫描。
备注：如果需要做超多色染色，扫描完后，从第四步开始操作，直到做完第二轮的多色染色，采用相同的机器进行第二轮的扫描。然后依次重复上面的操作，直到所有的抗体染色完并扫描。然后采用叠图软件对几轮扫描的图片进行重合叠图，并分析！
品名 货号 规格 单价（元） 品牌 备注 免疫荧光单标双色试剂盒 bry-0012-050 50T 1500 瑞雨生物（Runnerbio） 已含放大剂 免疫荧光单标双色试剂盒 bry-0012-100 100T 2200 瑞雨生物（Runnerbio） 已含放大剂 免疫荧光双标三色试剂盒（快速法） bry-0023-050K 50T 2500 瑞雨生物（Runnerbio） 已含放大剂，多聚二抗 免疫荧光双标三色试剂盒（快速法） bry-0023-100K 100T 4850 瑞雨生物（Runnerbio） 已含放大剂，多聚二抗 免疫荧光三标四色试剂盒（快速法） bry-0034-050K 50T 3500 瑞雨生物（Runnerbio） 已含放大剂，多聚二抗 免疫荧光三标四色试剂盒（快速法） bry-0034-100K 100T 5850 瑞雨生物（Runnerbio） 已含放大剂，多聚二抗 免疫荧光四标五色试剂盒（快速法） bry-0045-050K 50T 4500 瑞雨生物（Runnerbio） 已含放大剂，多聚二抗 免疫荧光四标五色试剂盒（快速法） bry-0045-100K 100T 7850 瑞雨生物（Runnerbio） 已含放大剂，多聚二抗 免疫荧光五标六色试剂盒（快速法） bry-0056-050K 50T 6500 瑞雨生物（Runnerbio） 已含放大剂，多聚二抗 免疫荧光五标六色试剂盒（快速法） bry-0056-100K 100T 11850 瑞雨生物（Runnerbio） 已含放大剂，多聚二抗 免疫荧光六标七色试剂盒（快速法） bry-0067-050K 50T 8500 瑞雨生物（Runnerbio） 已含放大剂，多聚二抗 免疫荧光六标七色试剂盒（快速法） bry-0067-100K 100T 14850 瑞雨生物（Runnerbio） 已含放大剂，多聚二抗