超多重荧光检测
TSA荧光多标检测操作流程
【原理】
TSA主要原理是利用酪胺Tyramide的过氧化物酶反应(酪胺盐在HRP催化H202下形成共价键结合位点)，产生大量的酶促产物，该产物能与周围的蛋白残基(包括色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基)结合，这样在抗原-抗体结合部位就有大量的生物素沉积，与随后加入的Streptavidin—HRP/荧光基团结合，经几次这样的循环放大，可以结合大量的酶分子or荧光基团，结果使其检测信号得到几何级放大
【试剂及材料】
1、实验器材
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名称 |
厂家 |
型号 |
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脱水机 |
上海徕卡仪器有限公司 |
ASP300 |
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包埋机 |
天津天利航空机电有限公司 |
BMJ-IB |
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病理切片机 |
上海徕卡仪器有限公司 |
RM2235 |
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冻台 |
武汉俊杰电子有限公司 |
JB-L5 |
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组织摊片机 |
武汉俊杰电子有限公司 |
JK-5 |
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烤箱 |
DHG-9960A |
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粘附载玻片 |
江苏世泰实验器材有限公司 |
188105 |
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盖玻片（24*32mm） |
江苏世泰实验器材有限公司 |
10212432C |
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刀片 |
日本羽毛牌 |
R35 |
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病理切片扫描仪 |
3DHISTECH |
PANNORAMIC SCAN II |
2、主要实验试剂
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试剂名称 |
厂家 |
货号 |
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无水乙醇 |
国药集团化学试剂有限公司 |
100092683 |
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二甲苯 |
国药集团化学试剂有限公司 |
10023418 |
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国药集团化学试剂有限公司 |
10019318 |
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国药集团化学试剂有限公司 |
10016318 |
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磷酸二氢钾 |
国药集团化学试剂有限公司 |
10017618 |
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磷酸氢二钠，无水 |
国药集团化学试剂有限公司 |
2004061933 |
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Tris-base |
Sigma |
648310 |
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EDTA |
Sigma |
E9884 |
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DAPI |
abcam |
ab104139 |
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剥离液 |
Runnerbio |
Bry-R001 |
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封闭液 |
Runnerbio |
Bey-B001 |
3、一抗及二抗信息
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一抗试剂名称 |
厂家 |
货号 |
稀释比 |
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二抗信息（试剂盒里面包含二抗及DAB显色系统） |
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HRP Conjugated Goat anti-Rabbit IgG UltraPolymer Antibody |
华安生物 |
HA1119 |
Ready-to-use |
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HRP Conjugated Goat anti-Mouse IgG UltraPolymer Antibody |
华安生物 |
HA1120 |
Ready-to-use |
2、主要实验试剂：
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TSA试剂盒 |
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CF 488 Tyramide |
runnerbio |
Bry-880488 |
即用型 |
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CF 594 Tyramide |
runnerbio |
Bry-880594 |
即用型 |
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cy3 Tyramide |
runnerbio |
Bry-880530 |
即用型 |
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AF 647 Tyramide |
runnerbio |
Bry-880647 |
即用型 |
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CF 754 Tyramide |
runnerbio |
Bry-880754 |
即用型 |
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480 Tyramide |
runnerbio |
Bry-880480 |
即用型 |
3、组织样本类型：人肿瘤，组织芯片，
样本1：
【操作流程】
1) 石蜡切片考片62℃烤片1h。
2) 切片脱蜡：组织切片置于三缸二甲苯中，每缸浸泡10分钟；
3) 水化：
a) 无水乙醇中浸泡2min；
b) 无水乙醇中浸泡2min；
c) 95%乙醇中浸泡2min；
d) 95%乙醇中浸泡2min；
e) 70%乙醇中浸泡2min；
f) 自来水水洗5分钟；
g) 蒸馏水清洗；
4) 将切片放入荧光淬灭试剂中，用光萃仪器荧光淬灭15min，(去除背景荧光和自发荧光)。
5) PBS洗涤3次，每次5min；
6) 热抗原修复（1mmol Tris-EDTA PH=9.0）：
a) 将洗涤的片子放入到塑料的架子上面，置于电高压锅中4min，室温自然冷却。
7) PBS洗涤3次，每次5min；
8) 除去PBS，每张片子加100ul的封闭液，室温孵育5min.
9) 去除血清，每张片子加入100ul的第一种一抗，室温1h
10) PBS洗涤3次，每次5min；
11) 除去PBS每张片子加入100ul标记的二抗，37℃下孵育20-30min；
12) PBS洗涤3次，每次5min；
13) 每张片子加入50ul的CF 594 Tyramide酪胺转换试剂，室温下孵育3-10min；
14) PBS洗涤3次，每次5min；
15) 重复操作步骤6-11(此时修复方法更换为剥离液，37度10min)。在第9步的时候加入更换第二中一抗100ul；
16) 每张片子加入50ul的第二种CF 488 Tyramide酪胺转换试剂，室温下孵育3-10min；
17) PBS洗涤3次，每次5min；
备注：重复操作6-11步，在第9步更换一抗，第11添加对应的hrp标记的二抗，第13步用酪胺转换试剂进行标记。直到做完需要标记的一抗。
18) 除去PBS每张片子加入100ul的防荧光淬灭封片剂（含DAPI），Digital Slide Scanners 机器扫描。
备注：如果需要做超多色染色，扫描完后，从第四步开始操作，直到做完第二轮的多色染色，采用相同的机器进行第二轮的扫描。然后依次重复上面的操作，直到所有的抗体染色完并扫描。然后采用叠图软件对几轮扫描的图片进行重合叠图，并分析！